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emsa凝膠遷移實驗電泳分析
點擊次數:672 發布時間:2016-08-26
emsa凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速,但要成功地進行凝膠遷移實驗,需要優化一些 參數,這主要受結合蛋白的來源和探針結合位點特點的影響。
以下是需要優化的因素:
抽提液的制備(核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解),結合蛋白的濃度,探針的濃度,非特異性探針的濃度,緩沖液的配方和pH,聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件,保溫時間和溫度,載體蛋白,是否有輔助因子(比如鋅,或鎘等金屬離子,或激素)。
 
emsa凝膠遷移實驗電泳分析: 
(1)用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色),以觀察電壓是否正常進行。 
(2)把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色),用于觀察電泳進行的情況。 
(3)按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,停止電泳。 
(4)剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注:通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板),把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘),輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
(5)干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測,或用其它適當儀器設備檢測。
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