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lip2000轉染試劑轉染實驗過程注意點
點擊次數:830 發布時間:2016-09-14
lip2000轉染試劑轉染實驗過程中需要注意以下幾點:
1.純化siRNA
在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA,推薦用玻璃纖維結合,洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和鹽離子。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在,如皮膚,頭發,所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等,此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性
通常,健康的細胞轉染效率較高。此外,較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗,推薦用50代以下的轉染細胞,否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。  
4.避免使用抗生素
從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下,可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗,以得到zui佳轉染效果。
5.選擇合適的轉染試劑
針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同,選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。
6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件
對大多數細胞,看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞(同樣適合實驗靶siRNA),轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。
7.通過標記siRNA來優化實驗
熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞,將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。
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